雙特異性抗體(Bispecific antibody，BsAb，簡稱雙抗)是指能夠特異性的結(jié)合兩個抗原或兩種特異性表位的人工抗體。
根據(jù)雙抗結(jié)構(gòu)劃分，可分為IgG-like雙特性異性(含有Fc區(qū))和non-IgG-like雙特異性抗體(不含F(xiàn)c區(qū))。IgG-like雙特性異性:含有FC區(qū)，分子量相對較大，F(xiàn)C區(qū)也有助抗體后期的純化。可提高溶解性，穩(wěn)定性，具有FC介導(dǎo)的效應(yīng)功能。
Non-IgG-like雙特異性抗體：非IgG-like雙抗在設(shè)計時去除了FC區(qū)，分子量一般較小，滲透性強，半衰期短，相對而言具有易于生產(chǎn)的特點。
雙抗不同類型分子結(jié)構(gòu)圖
雙抗在重組表達過程中會不可避免的產(chǎn)生錯配，不完整片段，以及聚集等副產(chǎn)物，這些雙抗的副產(chǎn)物主要分為：①錯配(主要包括重鏈之間錯配引起的同源抗體，輕鏈與重鏈之間錯配引起的異源抗體)，②抗體片段(缺失重鏈和輕鏈的雙抗副產(chǎn)物：如半抗體，3/4抗體)，③聚體(輕鏈聚集體，重鏈聚集體)等，這些雙抗副產(chǎn)物為雙抗藥物的下游工藝提出了較大的挑戰(zhàn)。
典型的雙抗雜質(zhì)表現(xiàn)
(2021 Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies)
針對不同的雙抗類型，需要多樣化的純化平臺來進行雜質(zhì)的去除，通?？梢赃M行以下路線的選擇：
不同雜質(zhì)類型可選擇填料種類
親和層析純化
Protein A親和層析在雙抗純化中具有捕獲和除雜的功能，是使用最多的一種層析方法。典型的親和層析是pH7.2±0.2的緩沖液中上樣，平衡緩沖液淋洗，醋酸，檸檬酸或甘氨酸緩沖液含有300~1000mM氯化鈉在pH5.0~6.0條件下洗雜，然后使用醋酸，檸檬酸或甘氨酸緩沖液在pH4.0~2.5條件下洗脫或者梯度洗脫。Protein A可以去除同源抗體，半抗及3/4抗體。對于一般難以去除的副產(chǎn)物，可以通過添加一定成分的添加物進行去除，比如：在洗脫和洗雜緩沖液中添加CaCl2可以提高半抗和同源聚體的去除；在洗脫和洗雜緩沖液中添加精氨酸可以提高半抗，工藝殘留的去除；在洗脫和洗雜緩沖液中添加MgCl2可以提高同源聚體的去除。
MaXtar® ARPA是一款耐0.5 mol/L堿，高載量，高分辨率的Protein A填料，在半抗，3/4抗體，同源聚體，單鏈缺失及聚體類雙抗副產(chǎn)物去除表現(xiàn)良好。目前廣泛應(yīng)用在多個抗體藥物的商業(yè)化生產(chǎn)中。
離子交換層析純化
離子交換層析是利用雙抗與雙抗副產(chǎn)物的等電點PI的差異，通過鹽梯度或pH梯度進行分離純化，在抗體純化應(yīng)用最多的精純步驟。一般情況下，只要雙抗與雙抗副產(chǎn)物的PI差異在0.5以上，就可以使用離子交換層析分離開。離子交換層析可以去去除同源聚體，3/4抗體，聚體。對于特別難以去除的3/4抗體，可以優(yōu)化緩沖液中添加PEG，CaCl2，精氨酸等，使用pH梯度的陽離子交換層析，可以獲得較好的去除效果。
MaXtar® Q、MaXtar® Q HR、MaXtar® S/SP、MaXtar® SP HR在抗體純化中應(yīng)用比較經(jīng)典的離子交換層析填料。MaXtar® S HC是一款高分辨，高載量(可達100mg IgG/ml以上的填料)的陽離子交換層析填料。
疏水層析純化
疏水層析根據(jù)雙抗與雙抗副產(chǎn)物的疏水性差異進行分離。在高鹽濃度下，雙抗表面疏水殘基暴露，與疏水填料表面結(jié)合，隨鹽濃度的降低，使得不同疏水強度的雙抗與雙抗副產(chǎn)物進行分離。高鹽濃度的緩沖液可能使蛋白與層析填料產(chǎn)生不可逆結(jié)合，在疏水緩沖液中添加5~15%的PEG或精氨酸可以促進洗脫和提高洗脫效果，增加回收率；也可使用高分辨率的MaXtar® Phenyl HR或MaXtar® Butyl HR的層析填料，以結(jié)合或流穿模式去除聚體。
MaXtar® Phenyl、MaXtar® Phenyl HR、MaXtar® Butyl、MaXtar® Butyl HR在雙抗純化可以有效的去除重鏈和輕鏈，聚體等雙抗副產(chǎn)物。
復(fù)合層析純化
混合模式層析利用層析填料的兩種或兩種以上相互作用機理進行分離的方法。比如：CHT可同時實現(xiàn)陽離子交換和鈣金屬親和兩種分離機制及MMC/MMA具有弱陽離子/陰離子交換和疏水層析兩種層析機理，可取去除同源聚體；由于復(fù)合模式層析的雙機理的分離功能，在去除雙抗副產(chǎn)物種具有獨特效果。混合模式層析在雙抗純化種應(yīng)用非常廣泛。
圖1：BarconCHT Type I的雙抗層析圖譜
表1：BarconCHT Type I純化雙抗的收率與純度
小結(jié)：
由于雙抗比單抗的副產(chǎn)物更復(fù)雜，需要針對不同類型的雙抗，依據(jù)親和力，電荷，疏水性等性質(zhì)差異，設(shè)計多種不同的下游工藝路線，去除副產(chǎn)物，提高雙抗的純度。百林科可以提供雙抗純化不同純化工藝路線如表2，表3-1，表3-2，在各種雙抗項目種表現(xiàn)優(yōu)異。
表2：百林科三步層析在某雙抗項目的應(yīng)用
表3-1：百林科三步層析在某雙抗藥物的應(yīng)用
表3-2：百林科三步層析在某雙抗藥物的備選應(yīng)用
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