電子凈化車間改造升級
 

　　2、PCR實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)設(shè)置
 

　　要完成一組PCR實(shí)驗(yàn)，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析4個實(shí)驗(yàn)過程。
 

　　這4個實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房應(yīng)相鄰布置，組成一個獨(dú)立的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)包括:試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。
 

　　PCR實(shí)驗(yàn)室整體平面布局
 

　　某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局如圖1所示，整個區(qū)域有一個公用走廊，每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
 

試劑準(zhǔn)備區(qū)
 

　　該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。
 

　　試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
 

　　試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。
 

　　房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染。
 

　　標(biāo)本制備區(qū)
 

　　該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。
 

　　標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進(jìn)行提取核酸的操作。
 

　　為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實(shí)驗(yàn)室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實(shí)驗(yàn)室中。
 

　　根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺，實(shí)驗(yàn)室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎海员苊鈴泥徑鼌^(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。
 

　　擴(kuò)增室
 

　　該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
 

　　在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
 

　　擴(kuò)增室主要配備PCR實(shí)驗(yàn)室的核心儀器PCR儀，本文實(shí)例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。
 

　　在實(shí)驗(yàn)室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
 

　　本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。
 

　　產(chǎn)物分析區(qū)
 

　　該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。
 

　　在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對負(fù)壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
 

　　本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。電子凈化車間改造升級
 

　　負(fù)壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓，對緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要，如室內(nèi)無潔凈要求，此處可以為0壓)。負(fù)壓緩沖室的布置如圖3所示。
 

4、
 

　　PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴(kuò)增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
 

　　工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分，各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。
 

　　合理的系統(tǒng)設(shè)置，合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。
 

　　規(guī)范的操作，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。清潔工作及時、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進(jìn)行清潔。
 

　　嚴(yán)格的管理:嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。在各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服(如不同顏色)，當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;
 

　　總之，實(shí)驗(yàn)室建設(shè)是一個復(fù)雜的問題，這里不討論人員的問題，實(shí)驗(yàn)室人員的培養(yǎng)與沉淀，也需要一個過程，在建設(shè)的過程中要因地制宜，不要生搬硬套，結(jié)合自己的實(shí)際慢慢摸索出適合自己發(fā)展的建設(shè)思路?？茖W(xué)合理建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，更好的發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室的作用。