一、概述
在正常細胞中，***脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發(fā)生凋亡zui早期，膜***脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側，這一變化早于細胞皺縮、染色質濃縮、DN**斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現象。AnnexinV是一種***脂結合蛋白，與***脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的***脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。***化丙***（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
二、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒的組份：
Product code Description
556547 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I
Components:
556547a Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E
556547b Annexin V-FITC (51-65874X)
556547c Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)
三、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒的操作步驟 ：
貼壁細胞需用0.25%的胰酶消化。注意過度消化可損傷細胞。在消化時可加2％的BSA可防止消化過度。如果用含EDTA的胰酶消化時，注意必須*清除EDTA：在標記前用1×PBS或1×bindingbuffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2＋螯合，影響Annexin V的結合。
（1）用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer；
（2）細胞收集。懸浮細胞收集：離心5分鐘；貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞膜上***脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合），于室溫2000rpm離心5～10分鐘，收集細胞；
（3）細胞洗滌：用預冷1×PBS（4℃）重懸細胞一次，2000rpm離心5～10分鐘，洗滌細胞；
（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞；
（5）Annexin V-FITC標記：加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15分鐘；
（6）PI標記：上機前5分鐘再加入5μL的PI染色。
（7）上機前，補加200μL的1×Binding Buffer。
四、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒的保存： 4℃保存，兩個月內可保持穩(wěn)定；避免反復凍融。
五、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒的注意事項 ：
（1）本試劑只適用于實驗，不適用于臨床檢測；
（2）PI（propidium iodide，***化丙錠）有毒性，能通過皮膚吸收，對眼睛有刺激作用，使用時需戴手套；
（3）Annexin V-FITC和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。在處理和標記時，盡可能在暗處進行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后，在暗室內用顯微鏡觀察；
（4）整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作，以免影響細胞狀態(tài)。
（5）在細胞洗滌的zui后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會影響實驗結果。
（6）為防止熒光衰變，宜在1小時內進行流式檢測。
（7）PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首*行Annexin V-FITC染色，zui短可在上機前5分鐘再加入PI染色。 | 
