Quick Cell PCR法支原體檢測(cè)試劑盒

Quick Cell PCR法支原體檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品描述

 《Quick Cell PCR法支原體檢測(cè)試劑盒》是一種廣譜的支原體檢測(cè)試劑盒，根據(jù)支原體DNA序列，本試劑盒可以識(shí)別所有100多種至今已發(fā)現(xiàn)的支原體?？捎糜跈z測(cè)所有可能含支原體的樣品，比如：（1）體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清；（2）血清；（3）各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）其他液體樣品。

試劑盒組成

（1） 支原體引物和內(nèi)參（100次）：200 μL

（2） 陽(yáng)性支原體DNA：50 μL

? 注意1：本試劑盒提供的支原體引物和內(nèi)參可供至少100次支原體檢測(cè)使用。

2：以下試劑需要自己準(zhǔn)備：（1）滅菌的去離子水；（2）普通的Taq DNA 聚合酶和相應(yīng)的緩沖液；（3）2.5 mM的dNTP；（4）6× DNA上樣緩沖液。

使用方法

1、待測(cè)樣品的準(zhǔn)備

為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品來(lái)源于至少培養(yǎng)3天且匯合度在70-90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)液上清（貼壁細(xì)胞）。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長(zhǎng)3天再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。取150 μL上述待測(cè)樣品，在普通臺(tái)式離心機(jī)上1200 rpm (大約150-200 g)離心5 min，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測(cè)，丟棄下層剩余的50 μL（含細(xì)胞沉淀）。收集并已經(jīng)離心去除細(xì)胞的待測(cè)樣品如果不立即檢測(cè)，請(qǐng)放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個(gè)月，在-80℃基本可以*保存。

注意：本步驟的低速離心是為了去除哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴(yán)格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被沉淀下來(lái)而支原體不會(huì)。如果錯(cuò)誤使用更高的離心力將可能導(dǎo)致支原體也被離心下來(lái)，從而導(dǎo)致假陰性。

2、PCR體系的配制。請(qǐng)按下表進(jìn)行PCR體系（總體積25 μL）配制:

3、PCR設(shè)置參數(shù)

4、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

（1） 配制1.5% DNA瓊脂糖凝膠。安全起見，建議選用李記生物的GelRe的核酸染料。

（2） 往每個(gè)PCR管內(nèi)加入5 μL 6× DNA上樣緩沖液。

（3） 取上述含DNA上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

（4） 當(dāng)溴酚藍(lán)染料跑出3厘米左右時(shí)，停止電泳，拍照。

結(jié)果判斷

  PCR擴(kuò)增的結(jié)果有可能出現(xiàn)以下幾種情況：

       注：“-”代表沒有條帶；“+”代表有條帶；“+”號(hào)越多代表?xiàng)l帶越強(qiáng)。

圖1. 支原體PCR擴(kuò)增結(jié)果。586 bp條帶為內(nèi)參條帶，270 bp左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會(huì)略有不同，總體在260-280 bp）。隨著支原體DNA模板的增加，270 bp左右的條帶會(huì)逐漸增強(qiáng)而586 bp的內(nèi)參條帶會(huì)逐漸減弱，甚至消失。泳道1：陰性對(duì)照或者沒有支原體污染的樣品；泳道2：極重度支原體污染樣品；泳道3：重度污染樣品；泳道4：中度污染樣品；泳道5：輕度污染樣品；泳道6：PCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。M：DNA marker.

注意事項(xiàng)

1、每次檢測(cè)都應(yīng)該設(shè)有陰性對(duì)照，作用有：（1）陰性對(duì)照會(huì)有一條586 bp的內(nèi)參條帶，這樣可以驗(yàn)證本試劑盒含有的支原體引物和內(nèi)參以及自己準(zhǔn)備的Taq DNA 聚合酶，dNTP等試劑沒有問題；（2）只有當(dāng)陰性對(duì)照的結(jié)果沒有出現(xiàn)270 bp左右的支原體特異條帶時(shí)，別的樣品的結(jié)果才是可信的。

2、如果586 bp條帶和270 bp左右的條帶都沒有出現(xiàn)（如圖1，泳道6），在排除PCR試劑的問題后（即陰性對(duì)照可以正常擴(kuò)增），說明該樣品含有抑制PCR擴(kuò)增的代謝產(chǎn)物。有關(guān)PCR的擴(kuò)增會(huì)被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制的問題，Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號(hào)MP0035）的PCR法支原體檢測(cè)試劑盒說明書中也特別提到了這點(diǎn)，說明這是一個(gè)PCR法支原體檢測(cè)中經(jīng)常遇到的問題，其強(qiáng)烈建議用試劑盒進(jìn)行DNA提取后再進(jìn)行鑒定。這也是PCR法支原體檢測(cè)的致命弱點(diǎn)。為了克服該問題，以下問題必須注意：（1）您購(gòu)買的PCR法支原體檢測(cè)試劑盒，其擴(kuò)增產(chǎn)物中必須含有內(nèi)參（Internal Contol）條帶作為對(duì)照【本試劑盒的586 bp條帶就是內(nèi)參條帶】。否則，如果沒有內(nèi)參作為對(duì)照，即使樣品擴(kuò)增后沒有支原體特異條帶，你也無(wú)法確定是因?yàn)闃悠反_實(shí)沒有支原體還是因?yàn)镻CR被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的假陰性。（2）如果出現(xiàn)PCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制時(shí)，請(qǐng)使用血液基因組DNA抽提試劑盒，抽提支原體DNA后再進(jìn)行PCR鑒定。（3）同時(shí)使用本公司生產(chǎn)的《Quick Cell支原體快速檢測(cè)試劑盒》進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)嚴(yán)格測(cè)試，該試劑盒的擴(kuò)增不會(huì)被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制。

3、根據(jù)支原體DNA的序列，本試劑盒可以識(shí)別所有100多種至今已發(fā)現(xiàn)的支原體，具有廣譜的識(shí)別能力。

4、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染，本公司提供細(xì)胞支原體清除和預(yù)防試劑。

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