EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液（24765）

EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液（24765）（核心成分為線性聚乙烯亞胺，也稱作LPEI），是新一代的轉(zhuǎn)染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進入細胞。除了具有陽離子脂質(zhì)體（如：Lipo2000,3000）的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，經(jīng)李記生物優(yōu)化處理，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低等特點。

EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液（24765）

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格	保存	價格(元)
EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液（24765）	C4058L1090	1mL	4℃	300

產(chǎn)品描述

EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液（核心成分為線性聚乙烯亞胺，也稱作LPEI），是新一代的轉(zhuǎn)染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進入細胞。除了具有陽離子脂質(zhì)體（如：Lipo2000,3000）的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，經(jīng)李記生物優(yōu)化處理，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低等特點。

EZ Trans（貨號：C4058L1090）核心成分Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000（PEI Max 40,000）, PEI Max 40,000是線性化聚乙烯亞胺PEI 25,000的升級產(chǎn)品，不同之處在于1）*水解（去乙?；?）比PEI25，000的鹽酸鹽形式，具更高的水溶特性；3）含更長連續(xù)性乙烯亞胺（ethyleneimine）片段，其質(zhì)子化氮水平比PEI 25,000提高11%以上。Thomas M，et al（2005）研究數(shù)據(jù)表明，去乙?；腜EI 40,000（Polyethylenimine MAX 40,000）體外質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率提高21倍，小鼠體內(nèi)靶向效率達到10,000倍，肺部特異療效顯示增強1500倍。本品經(jīng)堿中和后，可轉(zhuǎn)化為線性化自由胺（PEI），此時分子量正相當于25,000。PEI 23966與PEI 24765在轉(zhuǎn)染不同細胞及DNA時是各有優(yōu)勢，李記生物提供的EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液（C4058L1080，C4058L1090）核心成分PEI經(jīng)過優(yōu)化，顯著降低了細胞毒性。

使用方法

1. 接種細胞：用膠原酶消化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。轉(zhuǎn)染前 18-24 小時進行細胞的鋪板，以便在轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞的密度大約在 80%左右。注：培養(yǎng)液中的血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染效率。

2. 準備 EZ Trans-DNA 復合物
1）轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫 10 分鐘。下面，以轉(zhuǎn)染 24 孔板培養(yǎng)皿為例，說明轉(zhuǎn)染的具體方法（如果在別的培養(yǎng)器皿中進行轉(zhuǎn)染，各試劑建議使用量見表 1.：
2）將 1 μg 質(zhì)粒 DNA 稀釋到 40 μL 無血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用移液槍吹吸 3-4 次。
3）將 3 μL EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑稀釋到 40 μL 無血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用移液槍吹吸 3-4 次。
注： 無血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基是稀釋液， 不能使用含血清的培養(yǎng)基（ 包括 Opti-MEM） 進行 DNA 和 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋！因為 EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復合物的形成過程不能含有血清。
4）將稀釋好的 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒 DNA 中，立即用移液槍吹吸 3-4 次。
注： 此混合的順序不能反向進行！
5）室溫放置 10-15 分鐘，以形成 EZ Trans-DNA 復合物。 

 

表1：不同培養(yǎng)體積對應的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans、稀釋液用量

培養(yǎng)器皿	培養(yǎng)液體積（mL）	DNA量（μg）	EZ Trans (μL)	稀釋劑(μL)
48孔板	0.3	0.5	1.5	2 × 25
24孔板	0.5	1	3	2 × 40
12孔板	0.75	1.5	4.5	2 × 60
6孔板	1	3	9	2 × 125
35 mm培養(yǎng)皿	1	3	9	2 × 125
60 mm 培養(yǎng)皿	3	6	18	2 × 250
100 mm 培養(yǎng)皿	9	12	36	2 × 500

 

3. 轉(zhuǎn)染細胞

      1）將上述 80 μL EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復合物均勻滴入到含細胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動培養(yǎng)皿或輕微渦旋，讓 EZ Trans-DNA復合物分散均勻。 

      2）在 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細胞，轉(zhuǎn)染后 12-18 小時，去除含 EZ Trans-DNA 復合物的培養(yǎng)液。（若細胞形態(tài)欠佳，可在轉(zhuǎn)染 3-5h 后，添加 1/2 體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染 12-18 小時后*去除含 EZ Trans-DNA 復合物的培養(yǎng)液，用含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)液。）

      3）轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達，可根據(jù)需要在 24-48 小時內(nèi)檢測轉(zhuǎn)染效率。

      注： 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株， 可在上述操作后（ 轉(zhuǎn)染細胞 24 小時后） ， 將細胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（ 將細胞稀釋 10 倍 以上） ， 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。 在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下， 約 1～2 周可篩選到耐藥性克隆， 在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。

 

運輸與保存方法

      常溫運輸，4℃保存，保質(zhì)期12個月。

使用注意事項

      質(zhì)粒質(zhì)量：請務必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過260 nm光吸收測定DNA 濃度，260nm / 280nm比值確定 DNA 純度（比值應該在1.8～2.0的范圍之內(nèi)）。如有可能，請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性。

      細胞條件：使用適當保存和經(jīng)常傳代的健康細胞。確保培養(yǎng)基沒有被細菌、真菌或支原體污染。如果細胞是近期復蘇的液氮凍存細胞，請在轉(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細胞。„

特別提醒

1. 對于某些類型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度仍為70～80%。

2. 對于接觸抑制敏感的細胞，可適當降低鋪板密度。

3. 即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復合物仍能轉(zhuǎn)染細胞，但是DNA-PEI復合物必須在無蛋白存在的條件下形成。

4. 對大多數(shù)細胞來而言，每 1μg DNA 使用 3.0μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1μg DNA使用 1～4μL體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。

EZ Trans轉(zhuǎn)染液用于不同細胞轉(zhuǎn)染時用量參考（以96孔板為例）

細胞型號	培養(yǎng)基	每孔細胞數(shù)	DNA的量	轉(zhuǎn)染試劑量
293H	DMEM	3×104	0.2µg	0.5µL
293FT	DMEM	3×104	0.2µg	0.5µL
293E	DMEM	3×104	0.2µg	0.5µL
293F	DMEM	3×104	0.2µg	0.5µL
COS7	DMEM	1.5×104	0.4µg	0.5µL
hela	DMEM	2×104	0.3µg	0.5µL
Caco2	MEM	3.5×104	0.3µg	0.75µL
BHK21	MEM	2×104	0.2µg	0.5µL
CHO-DG44	DMEM+HT+pro	2×104	0.5µg	0.5µL
RAW264.7	DMEM	3×104	0.2µg	0.5µL
MCF7	MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat	2×104	0.1µg	0.25µL
SW480	IMDM	3×104	0.4µg	0.5µL
MDCK	DMEM	4×104	0.6µg	1µL
CHO-K1	IMDM+Pro	3×104	0.2µg	0.5µL
HepG2	DMEM	3×104	0.5µg	0.75µL
A549	DMEM	2×104	0.3µg	0.5µL
NIH/3T3	DMEM	1.5×104	0.1µg	0.75µL
vero	DMEM	3×104	0.3µg	0.75µL
sf9	SIM SF	5×104	0.4µg	0.75µL

 

附：幾種細胞轉(zhuǎn)染方法比較

                                                                      幾種細胞轉(zhuǎn)染方法（試劑）特點比較表                          

轉(zhuǎn)染方法	原理	主要應用	特點
陽離子聚合物 （EZ Trans）	帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團 形成帶正電的 復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進入細胞。	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 所有細胞	除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低等特點，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。
陽離子脂質(zhì)體法	帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細胞膜上的唾液酸殘基的負電 核結合；另一種解釋是通過細胞是內(nèi)吞作用而被進入細胞。(若DNA濃度過高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細胞的結合能力)	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 所有細胞	使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn) 染各種類型的細胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體 內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強烈的抗炎反應，導致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應用
DEAE-葡聚糖法	帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內(nèi)吞	瞬時轉(zhuǎn)染	相對簡便、重復比磷酸鈣好,但對細胞有一定的毒副作用,轉(zhuǎn)染時需除血清且一 般只用于BSC-1,CV-1,COS細胞系
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 染瞬轉(zhuǎn)染	不適用于原代細胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡 便但重復性差,有些細胞不適用細胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多
逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)	通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而 進入宿主細胞，之后反轉(zhuǎn)入酶 啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 特定宿主細胞	可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞，體內(nèi)細胞等,但攜 帶基因不能太大（<8kb）, 細胞需處分離期,需考慮安全因素
腺病毒 (雙鏈 DNA)	先和細胞表面的受體結合，繼而在αv整合素介導下被細 胞內(nèi)吞	瞬時轉(zhuǎn)染 特定宿主細胞	可用于難轉(zhuǎn)染的細胞,需考慮安全因素
Biolistic顆粒傳遞法 （基因槍粒子轟擊法）	將DNA用顯微重金屬顆粒沉 淀，再將包被好的顆粒用彈道 裝置投射入細 胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達	瞬時性轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染	可用于：人的表皮細胞， 纖維原細胞，淋巴細胞系以 及原代細胞
顯微注射法	用顯微操作將 DNA直接注入靶細胞核	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染	轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞
電穿孔法	高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 所有細胞	適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組 （>65kb）但細胞致死率高， DNA和細胞用量大，  需根 據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件，拷貝數(shù)較少 1-20

 

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