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詳細(xì)介紹
EZ ECL Pico化學(xué)發(fā)光液(皮克級(jí))
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 保存 | 價(jià)格(元) |
EZ ECL Pico化學(xué)發(fā)光液(皮克級(jí)) | D3030L1262 | 100 mL | 4℃ | 500 |
| (皮克級(jí)) | D3030L1263 | 500 mL | 4℃ | 2000 |
產(chǎn)品描述
《》是一款增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)HRP底物，可幫助用戶在免疫印跡分析過(guò)程中實(shí)現(xiàn)低皮克級(jí)的蛋白檢測(cè)(<10-12g)，極其節(jié)省抗體。本產(chǎn)品一抗?jié)舛确秶?/span>0.2-0.1μg/ml（以1 µg/mL儲(chǔ)存液稀釋1:1,000至1:5,000倍）；二抗?jié)舛?0-50ng/ml（以1 mg/mL儲(chǔ)存液稀釋1:20,000至1:100,000倍）。
EZ Pico底物，為使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)物的免疫印跡實(shí)驗(yàn)提供了明亮的信號(hào)、低至皮克級(jí)檢測(cè)靈敏度。該ECL底物能夠兼容各種膜、封閉液和寬范圍抗體稀釋液，以出色性能、通用性和高性價(jià)比，滿足用戶的免疫印跡應(yīng)用需求。
EZ Pico底物的特點(diǎn)：
• ECL — 用于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物
• 低至皮克級(jí)靈敏度 — 檢測(cè)硝化纖維素膜或PVDF膜上皮克級(jí)的蛋白條帶
• 長(zhǎng)信號(hào)持續(xù)時(shí)間 — 在條件優(yōu)化情況下，經(jīng)底物孵育的印跡條帶能夠持續(xù)輸出6至8小時(shí)的可檢測(cè)光信號(hào)
• 穩(wěn)定試劑 — 工作液在24小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定；試劑盒在室溫下可穩(wěn)定放置長(zhǎng)達(dá)1年
• 價(jià)格經(jīng)濟(jì) — 針對(duì)稀釋的抗體濃度條件進(jìn)行了優(yōu)化：
本產(chǎn)品優(yōu)于SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate，West Pico為T(mén)hermo Fisher公司產(chǎn)品（CAT:34077-34080）
運(yùn)輸與保存方法
室溫運(yùn)輸，4℃避光保存，質(zhì)保期大于12個(gè)月。
產(chǎn)品組分
組分名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào)規(guī)格及組分 | |
D3030L1262（100ml） | D3030L1263（500ml） | |
A液 | 50ml | 250ml |
B液 | 50ml | 250ml |
使用方法
1. 按常規(guī)方法執(zhí)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或者HRP標(biāo)記核酸探針?lè)跤?、洗膜?/span>
注：優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽(yáng)性結(jié)果。將一抗?jié)舛认♂尩?.2～1ug/ml，將二抗?jié)舛认♂尩?0～50ng/mL（*稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量）。
2. 新鮮配制發(fā)光工作液：根據(jù)用量將兩種組份按1:1比例混合均勻，備用。
注: 1) 短時(shí)間暴露于日光燈下不會(huì)損害該工作液，但為獲得*結(jié)果，將此工作液保存在棕色瓶中，避免暴露于任何強(qiáng)光。
2) 取A液和B液一定要用不同的槍頭，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。
3. 用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上（*100μl發(fā)光液/cm2膜），使之充分接觸。室溫孵育5分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。
4. 用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜*干燥。
5. 在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來(lái)*包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白條帶面向上。
6. 將X光膠片置于膜的上面。建議*次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到*結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是zui劇烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間下降，如底物孵育較長(zhǎng)時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長(zhǎng)以獲得較強(qiáng)信號(hào)。如果使用磷光存儲(chǔ)成像設(shè)備（如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng)）或CCD照相機(jī)可能需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間。
注意：膠片與膜之間的任何相對(duì)移動(dòng)，可能在膠片上造成人為的非特異信號(hào)。
7. 使用合適的顯影劑和定影劑對(duì)膠片進(jìn)行顯影。如果信號(hào)太強(qiáng)，則縮短曝光時(shí)間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測(cè)。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
問(wèn)題 | 可能問(wèn)題 | 解決方案 |
膠片反轉(zhuǎn)像（即黑色背景，白色帶） | 系統(tǒng)中HRP過(guò)多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
膜上有褐色或黃色帶 | ||
印記在暗室中發(fā)光 | ||
信號(hào)持續(xù)時(shí)間少于8小時(shí) | ||
信號(hào)弱或無(wú)信號(hào) | 系統(tǒng)中過(guò)多的HRP耗盡了底物并導(dǎo)致信號(hào)迅速衰減 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
抗原或抗體的量不足 | 增加抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印 | |
HRP或底物活性低 | 見(jiàn)下文注釋 | |
高背景 | 系統(tǒng)中HRP過(guò)多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
封閉不充分 | 優(yōu)化封閉條件 | |
封閉式機(jī)不合適 | 嘗試一種不同的封閉試劑 | |
洗滌不充分 | 增加洗滌時(shí)間、次數(shù)或洗滌緩沖液體積 | |
膠片過(guò)度曝光 | 縮短曝光時(shí)間或使用背景消除劑 | |
抗原或抗體的濃度太高 | 減少抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)條內(nèi)有斑點(diǎn) | 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印流程 |
膜的水化不均勻 | 按照制造商建議適度的使膜水化 | |
膠片與膜之間存在氣泡 | 在膠片曝光前，去除氣泡 | |
膠片上背景有斑點(diǎn) | HRP標(biāo)記二抗中存在聚集物 | 使用0.2um的過(guò)濾器 |
非特異性條帶 | 系統(tǒng)中HRP過(guò)多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍。 |
SDS導(dǎo)致的蛋白非特異性結(jié)合 | 在檢測(cè)過(guò)程中不使用SDS |
檢測(cè)系統(tǒng)有效性（如需要）：在暗室中，在一個(gè)清潔試管中加入將1-2ml底物工作液。關(guān)閉燈，添加1ul未稀釋的HRP標(biāo)記二抗工作液。該溶液應(yīng)當(dāng)立即發(fā)出藍(lán)色光，藍(lán)光信號(hào)在隨后的幾分鐘漸淡。
注意事項(xiàng)
（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過(guò)久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
（2）長(zhǎng)時(shí)間曝光或蛋白過(guò)量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見(jiàn)，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見(jiàn)但可使X光膠片曝光。不能簡(jiǎn)單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見(jiàn)的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。
（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈*大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗體濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶，導(dǎo)致失敗。
（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。
（6）使用肉眼可見(jiàn)的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。
（7）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過(guò)0.01%。
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