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新型Ambr®250反應器助力細胞與基因治療工藝開發(fā)
摘 要
Ambr®250，是用于細胞(如CHO)培養(yǎng)的優(yōu)秀自動化反應器平臺，促進了培養(yǎng)工藝開發(fā)與表征研究工作。但由于細胞之間基因差異，在培養(yǎng)細胞與基因治療產(chǎn)品的細胞(如T細胞)時，所需要的流體動力學特性與培養(yǎng)CHO細胞有顯著區(qū)別，常規(guī)的Ambr®250反應器(雙槳+擋板)用于培養(yǎng)此類細胞時，其所提供的流體環(huán)境并非最優(yōu)，限制了細胞生長。基于此，Sartorius在原來的反應器容器上進行專項優(yōu)化，并進行細胞培養(yǎng)試驗驗證。結(jié)果表明，新型Ambr®250反應器(單槳+無擋板)更有利于微載體懸浮培養(yǎng)并改善細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，從而獲得了更高的細胞密度。
關(guān)鍵詞：Ambr®250反應器容器、T細胞、人間質(zhì)干細胞(hMSC)、計算流體力學(CFD)
背 景
常規(guī)的Ambr®250反應器配備雙槳+四塊擋板，這種反應器廣泛應用于CHO細胞培養(yǎng)并取得了良好的培養(yǎng)效果。但該反應器用于培養(yǎng)細胞與基因治療產(chǎn)品的細胞時(如hMSC、T細胞，此類細胞往往需要添加微載體/活化磁珠)，難以將微載體充分懸浮，導致細胞生長受阻。如果只是單純的增加攪拌轉(zhuǎn)速，又存在細胞損傷風險。為解決該問題，Sartorius擬定方案進行測試，利用計算流體動力學(CFD)模擬輔助分析，并通過細胞培養(yǎng)試驗驗證，開發(fā)出一款真正適合此類細胞培養(yǎng)的Ambr®250反應器。
方案擬定與確認
在常規(guī)Ambr®250反應器容器培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞(MSC)時，常常發(fā)現(xiàn)所使用的微載體難以懸浮，并且可以觀察到容易聚集在擋板附近，這使得細胞難以附著在微載體上，影響了細胞正常生長。該現(xiàn)象表明，擋板不利于微載體懸浮細胞培養(yǎng)，所以第一個改進優(yōu)化項便是去除擋板。
攪拌槳是反應器的核心，其幾何形狀對流場影響較大，因此除了擋板之外，還需要進一步優(yōu)化攪拌槳。對Ambr®250反應器槳型重新設(shè)計，期望找到更適合微載體懸浮細胞培養(yǎng)的攪拌槳。擬定了8個方案，如圖1所示。
圖1.槳型設(shè)計方案(左：CAD畫圖；右：基本幾何形狀)
使用這8個新型攪拌槳型的Ambr®250反應器進行微載體懸浮試驗，即將微載體分別加入含有一定體積水溶液的容器中，提高攪拌轉(zhuǎn)速至恰好能將微載體懸浮，結(jié)果見表1。從結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，Paddle和象耳槳A所需要的攪拌轉(zhuǎn)速和能量最小，換言之，使用這兩種槳攪拌在低轉(zhuǎn)速條件下更容易使微載體懸浮。同時考慮細胞剪切損傷，根據(jù)Kolmogorov尺度λ，Paddle和象耳槳A(Elephant ear A)所對應的尺度更大，細胞更不容易損傷，這對于剪切敏感型細胞尤為重要。但考慮到Paddle槳是一種徑向流槳，一般不用于動物細胞培養(yǎng)，此外，根據(jù)象耳槳C、D方案獲得的測試結(jié)果可知，增加槳葉對微載體懸浮作用有限，因此軸向流象耳槳A(單槳)可能是最佳方案。
表1 微載體懸浮實驗結(jié)果
JS:剛好能懸浮
CFD模擬分析
在初步確認象耳槳A方案后，使用CFD軟件進行流場模擬分析，創(chuàng)建模型，設(shè)置轉(zhuǎn)子域，劃分網(wǎng)格，采用標準湍流k-e模型進行單相流模擬，如圖2所示。其流場結(jié)果見圖3，可以看到相較于有擋板的反應器設(shè)計，無擋板反應器攪拌槳下方的流體運動更充分，能夠給該區(qū)域帶來更大能量促進位于此處的微載體懸浮，這也解釋了為什么常規(guī)Ambr®250反應器容器培養(yǎng)下，微載體難以懸浮。結(jié)合先前的實驗測試結(jié)果，基本可以確認無擋板+單象耳槳A是優(yōu)方案。
圖2.轉(zhuǎn)子域與網(wǎng)格創(chuàng)建(象耳槳A方案)
圖3.象耳槳A流場模擬(左：有擋板；右：無擋板)
細胞培養(yǎng)驗證
在鎖定理論最佳反應器后，進行T細胞和人間充質(zhì)干細胞(MSC)培養(yǎng)試驗，以確認使用改進優(yōu)化后的Ambr®250反應器培養(yǎng)這兩種細胞能否獲得更優(yōu)的培養(yǎng)效果。具體細胞培養(yǎng)方案如下(表2，表3)：
表2 T細胞培養(yǎng)方案
表3 人間質(zhì)干細胞培養(yǎng)方案
實驗結(jié)果
如圖4、5所示，相較于原始反應容器、T175瓶及轉(zhuǎn)瓶，使用新型單槳無擋板的反應器容器進行細胞培養(yǎng)可以獲得更高的細胞密度，該結(jié)果表明，新型Ambr®250反應器更適合培養(yǎng)T細胞/人間充質(zhì)干細胞這類需要磁珠/微載體輔助的細胞。
圖4.T細胞培養(yǎng)結(jié)果
圖5.人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)結(jié)果
結(jié) 論
賽多利斯從細胞培養(yǎng)本質(zhì)出發(fā)，結(jié)合T細胞/人間充質(zhì)干細胞(MSC)工藝特點，分析原始反應容器不足后進行優(yōu)化設(shè)計并測試，借助CFD模擬輔助手段，在多種設(shè)計方案中快速鎖定優(yōu)方案。最終細胞培養(yǎng)實驗表明，使用新型Ambr®250反應器培養(yǎng)細胞，細胞密度會顯著高于改良優(yōu)化前的反應器，甚至要優(yōu)于T175瓶/轉(zhuǎn)瓶。該反應器與T細胞/人間充質(zhì)干細胞這類需要磁珠/微載體培養(yǎng)的細胞適配性好，能夠幫助用戶實現(xiàn)快速工藝開發(fā)。
參考文獻
Rotondi, Marco et al. “Design and development of a new ambr250® bioreactor vessel for improved cell and gene therapy applications.” Biotechnology letters vol. 43,5 (2021): 1103-1116. doi:10.1007/s10529-021-03076-3
Costariol E et al (2019) Establishing the scalable manufacture of primary human T-cells in an automated stirred-tank bioreactor. Biotechnol Bioeng 116:2488–2502.
Keller, Marco et al. “CFD‐Aided and Experimental Characterization of Bioreactors under Low Power Input Conditions.” Chemie Ingenieur Technik (2022): n. pag.