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PCR檢測實驗室建設(shè)

PCR實驗室建設(shè)基本屬于特種實驗室建設(shè)中的一種，例如現(xiàn)在我國病毒疫情頻發(fā)，就需要各地市醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)一步加強(qiáng)PCR實驗室建設(shè)，擴(kuò)展病原微生物的檢驗項目，提高當(dāng)?shù)匦l(wèi)生應(yīng)急檢測能力，為人民群眾的身體健康保駕護(hù)航，為政績?yōu)槊裆龀龈玫呢暙I(xiàn)。是一項在時間內(nèi)體外大量擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR實驗室或稱PCR擴(kuò)增實驗室,就是進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的實驗場所。   

  PCR實驗室的設(shè)計

PCR實驗室的空間設(shè)計有其固定的模式,PCR實驗室面積及實驗用房的要求基本一致,與醫(yī)院本身或檢測機(jī)構(gòu)的規(guī)模、日門診量等關(guān)系不大。

PCR是由四間相鄰的實驗室組成,包括試劑準(zhǔn)備區(qū)(產(chǎn)品準(zhǔn)備區(qū))標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū),通常每間面積在10m2左右。在使用實時熒光PCR儀、HIV病毒載量測定儀的PCR實驗時,通?？蓛H設(shè)立三間實驗室。

       PCR實驗室的平面設(shè)計有嚴(yán)格的要求,為避免污染,流線必須不可逆,且只能是按試劑備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)的順序單向序列。PCR實驗室之間必須有單獨的內(nèi)部走廊,不能使用公共走廊,各實驗室間需要有傳遞窗進(jìn)行標(biāo)本無菌傳遞,進(jìn)入四間實驗室之前都必須要過緩沖空間。各區(qū)必須相互獨立,儀器設(shè)備和各種物品應(yīng)嚴(yán)格分開,不能混用。每間實驗室內(nèi)須安裝紫外線燈,供實驗前后進(jìn)行空氣消毒。

為保證實驗的準(zhǔn)確性,試劑準(zhǔn)備區(qū)及標(biāo)本制備區(qū)的風(fēng)壓宜呈微正壓,以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入,造成污染,通過控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓,以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散污染試劑與樣品,通過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。理想情況下緩沖內(nèi),可設(shè)置正壓,使室內(nèi)空氣不流向室外,室外空氣不流向室內(nèi)。

PCR實驗室典型平面圖

PCR實驗室的設(shè)計與建設(shè)技術(shù)要求

《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了PCR實驗室每個區(qū)所需的儀器設(shè)備一覽表

PCR實驗室的裝修

⊙主體結(jié)構(gòu)：主題為彩銅板、鋁合會型材。內(nèi)所有陰角、陽角均采用銅合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染，積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

⊙標(biāo)準(zhǔn)的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將PCR過程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增檢測三個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū)1,緩沖區(qū)2和PCR擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。

⊙消毒：在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試列準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進(jìn)行局部消毒

⊙機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖不銹鋼(不建議使用電子連鎖方式)傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染(人物分流)。

⊙地面：地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚(至少800mm*800mm)接縫需要小于2mm.

⊙照明：燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點

PCR實驗室建設(shè)延申閱讀

基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置

臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室。 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。 清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

PCR實驗室建設(shè)

(一)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。

含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來決定。

主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(shù)(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。

在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。 嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。

工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長照射時間，*好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。

(二)標(biāo)本制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。 要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。 用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料(原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。 對實驗臺適當(dāng)?shù)淖贤庹丈?254nm波長，與工作臺面近距離)適合于滅活去污染。可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。 樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標(biāo)本檢測前對提取方法進(jìn)行評價。 用于RNA擴(kuò)增檢測樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。 cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。 待測RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(三)擴(kuò)增區(qū)

下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。 為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。 完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。 核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。 本區(qū)是*主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護(hù)。 本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。

了解了PCR實驗室的工藝標(biāo)準(zhǔn)后，我們就能大致確認(rèn)PCR實驗室的布局、所需的設(shè)備、整體的設(shè)計裝修、PCR實驗室的通風(fēng)系統(tǒng)、PCR實驗室建設(shè)注意事項等。

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