摘要:采用反相C18毛細管液相色譜柱,以乙腈（含0.1%（體積分數(shù),下同）三氟乙酸）和水（含0.1%三氟乙酸）為流動相梯度洗脫,在26min內(nèi)分離了葛根異黃酮提取物以及愈風寧心片中的主要成分。采用毛細管液相色譜/四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀對葛根提取物以及片劑中的幾種主要異黃酮類化合物做了結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)葛根素是主成分（提取物中其平均質(zhì)量分數(shù)是13.32%;片劑中每片含量19.28～24.34mg）。對微量未知化合物,用它們的子離子譜圖與已知化合物的譜圖比較,推測其成分為3-甲氧基葛根素和3-甲氧基大豆苷。
    關(guān)鍵詞:反相毛細管液相色譜；液相色譜；電噴霧離子質(zhì)譜；葛根異黃酮；葛根素；中藥
    野葛（Pueraria lobata （willd.） Ohwi）為豆科（Leguminosae）葛屬植物, 是重要的藥用植物之一,其根為常用生藥（其中黃酮類化合物的質(zhì)量分數(shù)可達10%～14%） ,具有降低血管阻力,改善心、腦血液循環(huán), 減慢心率, 降低心肌耗氧量等藥理作用,在肌體抗氧化、退熱止汗、治嘔吐、防治老年癡呆癥等方面也有治療作用。葛根中主要異黃酮成分為葛根素（puerarin） 、大豆苷（daidzin） 、大豆苷元（daidzein）等, 據(jù)報道這幾類化合物都具有藥理活性。
    目前,對葛根異黃酮提取物的測定方法主要有液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法以及　野葛（ Puera rialobata （willd.）Ohwi）為豆科（Leguminosae）葛屬植物, 是重要的藥用植物之一,其根為常用生藥（其中黃酮類化合物的質(zhì)量分數(shù)可達10%～14%） ,具有降低血管阻力,改善心、腦血液循環(huán), 減慢心率, 降低心肌耗氧量等藥理作用,在肌體抗氧化、退熱止汗、治嘔吐、防治老年癡呆癥等方面也有治療作用。葛根中主要異黃酮成分為葛根素（puerarin） 、大豆苷（daidzin） 、大豆苷元（daidzein）等, 據(jù)報道這幾類化合物都具有藥理活性。
    目前,對葛根異黃酮提取物的測定方法主要有液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法以及毛細管電泳紫外、熒光或者電化學檢測法等。但上述方法無法對提取物中的未知化合物進行定性。液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）已廣泛應(yīng)用于未知化合物的定性分析,尤其近年來發(fā)展起來的生物質(zhì)譜采用軟電離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),可得到很強的分子離子峰以及易于解析的分子碎片峰,從而可確定基團的連接位置,進一步推斷化合物的結(jié)構(gòu)。
    本文以優(yōu)化的乙腈-水（含0.1%（體積分數(shù)）三氟乙酸）流動相體系, 用梯度洗脫模式分離了葛根提取物以及葛根制劑愈風寧心片中的主成分（葛根素、大豆苷、大豆苷元等） ; 同時采用LC-MS-MS對提取物中的異黃酮類化合物進行定性。結(jié)果表明,該方法適用于上述活性成分的定性分析。
    1　實驗部分
    1. 1　儀器與試劑
    毛細管液相色譜系統(tǒng):Micro-Tech毛細管液相色譜儀,四元梯度泵, Linear 200 UV-VIS檢測器,Chrom-Perfect色譜工作站（Micro-Tech Scientific Inc） 。LC-MS聯(lián)用系統(tǒng):Waters 毛細管液相色譜（CapLC）系統(tǒng),包括自動進樣器、三元高壓微流量泵系統(tǒng)、二極管陣列檢測器（PDA） 、電噴霧-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（ ESI-Q-TOF） （Wa ters公司）和Masslynx質(zhì)譜工作站。
    試劑:乙腈,甲醇（色譜純, Fluka公司）,實驗用水為娃哈哈純凈水。乙醇、三氟乙酸、醋酸銨均為分析純。葛根素、大豆苷元購自中國藥品生物制品檢定所（含量≥98% ） 。
    1. 2　樣品的配制
    葛根提取物（總異黃酮含量（質(zhì)量分數(shù)）≥40% ）由西安天誠醫(yī)藥生物工程公司提供。稱取葛根提取物10mg,置于10mL容量瓶中,采用甲醇定容至刻度并搖勻。所有溶液用0.45μm微孔濾膜過濾,濾液保存于4℃冰箱中備用。
    葛根制劑愈風寧心片（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠）供試品溶液的制備: 取本品一片（ 0.28g/片） , 除去糖衣, 研碎, 精密稱取0.223mg,放入5mL 帶刻度離心管中, 加入5mL30%（體積分數(shù),下同）乙醇,超聲處理30 min后,冷卻,用30%乙醇補足減少的體積。搖勻后,靜置1h,然后離心（ 3000r /min） 30min,取上清液過濾, 濾液
作為供試品溶液,保存于4℃冰箱中備用。
    1. 3　分析條件
    1. 3. 1　液相色譜條件
    C18毛細管液相色譜柱（150mm×0.32mmi.d.,5μm ,Micro-Tech Scientific Inc） 。流動相A為含0.1%（體積分數(shù),下同）三氟乙酸的乙腈溶液,流動相B為含0.1%三氟乙酸的水溶液,梯度洗脫:0～30min, 流動相A的體積分數(shù)由5%到40%;在隨后的5min, 流動相A的體積分數(shù)為95%。在下次分析前用體積分數(shù)為100%的流動相B平衡10min,流速8.0μL /min。檢測波長248nm ,柱溫25℃,進樣量320nL。
    1. 3. 2　液質(zhì)聯(lián)用分析條件
    C18色譜柱（100mm×0.32mm i.d.,5μm,Waters） ,流動相A為10mmol/L醋酸銨乙腈溶液,流動相B為10mmol/L醋酸銨水溶液,梯度洗脫:0～30min,流動相A的體積分數(shù)由5%到70%,流速4.0μL/min。PDA檢測波長210～400nm,柱溫25℃,進樣量200nL。
    質(zhì)譜分別采用正、負離子檢測模式:正離子模式下毛細管電壓3030V,錐孔電壓30V。負離子模式下毛細管電壓- 2250V,錐孔電壓35V,掃描范圍m/z200～800。干燥氣為N2,流量450L/h,脫溶劑氣溫度200℃,離子源溫度80℃。用氬氣作碰撞氣進行碰撞誘導裂解（CID） ,碰撞能量15～35eV。
    2　結(jié)果與討論
    2. 1　微柱液相色譜分離
    葛屬植物成分復(fù)雜, 其中主要活性成分為異黃酮類化合物。目前在葛屬植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約35種異黃酮類化合物,而在葛根提取物中主要存在葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木苷等異黃酮。在甲醇-水體系下,葛根提取物中的主成分葛根素與其他成分難以*分離。本文采用乙腈-水體系,分離了葛根提取物中的幾種異黃酮。葛根提取物中的主成分葛根素（平均質(zhì)量分數(shù)為13.32%）的保留時間、峰高和峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.18%,1.53%,3.18%（n=5） 。
    2. 2　葛根片劑的分析
    采用上述優(yōu)化條件, 對愈風寧心片樣品溶液進行測定。在葛根提取物樣品中,葛根素的平均（n=5）保留時間為2.14min;而在片劑樣品中,葛根素的平均（n=5）保留時間為2.20min。片劑中葛根素（含量為19.28～24.34mg /片）的保留時間、峰高和峰面積的RSD（n=5）分別為1.26%,4.79%,7.17% ,說明方法的重現(xiàn)性較好。因此采用該流動相組成和梯度洗脫方法, 可以對中藥提取物以及中藥制劑中的葛根素進行定
性分析。
    2. 3　葛根提取物的LC-MS分析
    其中1, 2, 3, 4號峰的紫外吸收光譜圖可看出,1,2,3,4號峰的紫外吸收光譜與異黃酮類化合物的紫外特征吸收峰相似。
    用葛根素和大豆苷元標樣分別在正離子模式和負離子模式下直接進樣,所得質(zhì)譜圖（未列出）表明,在正離子模式直接進樣的情況下,由于加和離子的存在以及溶劑中雜質(zhì)在該模式下易于離子化而形成干擾,譜圖比較復(fù)雜, 因此無法進行深入的解析。而在負離子模式下直接進樣的譜圖比較清晰, 沒有雜質(zhì)峰干擾。因此,本文采用毛細管液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用,在負離子模式下進行分析,得到總離子流圖。
    從總離子流圖中幾個主要峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn),圖中9.77min流出峰的質(zhì)譜特征峰的m/z與大豆苷元的質(zhì)譜特征峰的m/z253（[M-H]-）相同,因此可以斷定該峰為大豆苷元。圖中5.70min流出峰的質(zhì)譜特征峰的m/z值與葛根素和大豆苷的相同,但無法確定是這兩種異構(gòu)體中的哪一種化合物,因此采用LC-MS/MS對該峰進一步進行碎片分析。從文獻可知,葛根素在8位形成糖苷,屬于碳苷類異黃酮;而大豆苷在7位形成單糖鏈苷,屬于氧苷類異黃酮。氧苷類異黃酮的單糖鏈與異黃酮通過C—O鍵相連, 其穩(wěn)定性弱于通過C—C鍵相連的碳苷,因此在形成子離子時,主要失去了相對分子質(zhì)量（Mr）為162的碎片離子,形成糖苷配基大豆苷元的脫質(zhì)子峰,其m/z為253。因此可以推斷,5.70min流出峰為大豆苷。從圖可以看到,2.93min流出峰是多組分。我們分別以m/z415,445,546為母離子進行MS/MS分析。在碰撞能量僅為15eV時,該化合物即失去了Mr為120的碎片離子而形成m/z 297的子離子,因此可以推斷其為碳苷類異黃酮葛根素。
    母離子445失去一個Mr為120的碎片離子形成325.04的子離子峰,隨后的碎裂片斷既包含了氧苷也包含了碳苷的碎裂途徑,因此推斷該化合物可能是3′2甲氧基葛根素和3′2甲氧基大豆苷的混合物。2.93min流出的峰以m / z 546為母離子進行分析得到的子離子譜圖,該母離子的碎片峰沒有給出太多的結(jié)構(gòu)信息,雖然與72木糖葛根素的特征峰m/z547（[M-H]-）相似,但目前還無法確定該化合物結(jié)構(gòu)。
    可確定3.15min流出峰主要為葛根素,4.34min流出峰為大豆苷。由于大豆苷元含量低,因此在聯(lián)用分析中未被檢測到,但在質(zhì)譜直接進樣分析中發(fā)現(xiàn)存在微量的大豆苷元以及m/z為445, 546的化合物。對分子離子峰為m/z 445的化合物進行串聯(lián)質(zhì)譜分析, 與葛根提取物中m/z為445的化合物碎裂片斷相同,可以確定為3′2甲氧基葛根素和3′2甲氧基大豆苷的混合物,而分子離子峰為m/z546的化合物目前還無法確定結(jié)構(gòu)。
    3　結(jié)語
    本文以乙腈-水為流動相,在反相色譜中分離了葛根提取物以及中藥片劑中的主要成分。采用液質(zhì)聯(lián)用方法對提取物及其片劑中的主成分進行了定性,并對其中兩種微量成分的結(jié)構(gòu)進行了推測。但另外一種微量成分目前還無法確認, 對其結(jié)構(gòu)需要進一步深入地研究。
參考文獻:
[1] Pharmacopoeia Commission of People’s Republic of China. Pharmacopoeia of People’s Republic of China, Vo l 1. Beijing: Chemical Industry Press （中國藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）.北京:化學工業(yè)出版社）,2000.273
[2]Lai Yanglin, Tang Bing. China Journal of Chinese Materia Medica （賴洋林,唐冰.中國中藥雜志） ,1989, 14（5）:52