摘要：采用三波長-分光光度法測定苦丁茶中有效化學(xué)成分黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析能造成的影響，并校正了基于干擾組分（飲料中添加劑等）的吸收光譜具有可能是散射造成的背景線性吸收產(chǎn)生的基線傾斜。回歸方程為：ΔA=-3.702×0.001+3.7023C，相關(guān)系數(shù)r=0.9994，黃酮的濃度在600—1600mg／L范圍內(nèi)，分別在波長為λ1=470nm，λ2=420nm，λ3=370nm處測吸光度時(shí)，則△A與濃度C之間呈良好的線性關(guān)系，可按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。方法的回收率為98％一112％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.14％。方法的準(zhǔn)確度與精密度均令人滿意，而且操作簡便易行。
關(guān)鍵詞：總黃酮，苦丁茶，三波長-分光光度法
1 引 言
苦丁茶是植物冬青科冬青屬苦丁茶（L／ex Kudincha C．J．Tseng）的葉?？喽〔?，又稱“生態(tài)茶”，含有多種生物活性成分、l8種氨基酸和各種微量元素，具有提神醒腦，清熱解毒，清肝明目、降脂、降壓、解煙、解酒等功效，藥用價(jià)值較高，因而引起人們廣泛注意。有關(guān)苦丁茶在生藥學(xué)及其藥理作用等方面的研究報(bào)道較多，對于黃酮類化合物的相互分離以及單一黃酮成分的定量分析，常用的方法有熒光光度法、液相色譜法。而對于評價(jià)和監(jiān)測含黃酮類天然產(chǎn)物的總黃酮含量的測定往往采用分光光度法。一般常用的分光光度法存在一定缺陷，如果加入鋁鹽會使黃酮類化合物與鋁離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，而且吸收帶I會明顯產(chǎn)生紅移，吸光度也大大增加。但由于干擾成分使吸收峰不對稱給定量分析造成一定的影響。本實(shí)驗(yàn)采用三波長-分光光度法 測定苦丁茶中黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，并校正了基于干擾組分（飲料中添加劑等）的吸收光譜具有可能是散射造成的背景（散射與波長有關(guān)，在短波處散射較強(qiáng)）線性吸收產(chǎn)生的基線傾斜。
在黃酮類化合物的紫外光譜吸收中，主要吸收帶是由300～400nm之間的吸收帶I和240～280nm之間的吸收帶Ⅱ組成。因?yàn)榭喽〔柚泻邪被?、維生素和生物堿等化合物，在帶I和帶Ⅱ范圍內(nèi)均有一定程度的吸收，會對黃酮的測定產(chǎn)生干擾。加入鋁鹽使黃酮類化合物與鋁離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，其反應(yīng)過程。
則吸收帶I會明顯產(chǎn)生紅移，同時(shí)吸光度也大大增加。因此，選擇鋁絡(luò)合物顯色體系來測定苦丁茶中總黃酮的含量。但由于吸收峰不對稱給定量分析造成一定的影響。采用三波長-分光光度法測定苦丁茶中黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，并校正了基于干擾組分的吸收光譜具有線性吸收產(chǎn)生的基線傾斜，提高了定量分析的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)選用430、353和284nm處測量吸光度，黃酮濃度在600～1600mg／L范圍內(nèi)，△A與濃度C呈良好的線性關(guān)系。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2．1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料
TU-1201紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52CS型（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋HHS21-4型（上海醫(yī)療器械五廠）；旋片式真空泵2XZ-4型（臨海市精工真空設(shè)備廠）；中華牌加熱器ZHQ型（鞏義市英峪儀器一廠）；電子節(jié)能控溫儀DKW一Ⅲ型（鞏義英峪儀器一廠）。
黃酮標(biāo)準(zhǔn)品：由遼寧生物技術(shù)科學(xué)股份有限公司提供。1％的AlCl3溶液：稱取AlCl3·6H20 1.7567g，加水溶解并稀釋至100mL。黃酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.2 g黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（準(zhǔn)確至0.0001 g），置于100mL的容量瓶中，加水使其溶解稀釋至刻度，搖勻備用；所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。
苦丁茶：海南產(chǎn)苦丁茶和桂林產(chǎn)苦丁茶。
2．2 吸收曲線的繪制及三波長的確定
準(zhǔn)確吸取黃酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL，注入10mL容量瓶中，加1％的AlCl3，溶液，充分混合至刻度，用1cm的比色皿在波長200～600nm范圍內(nèi)掃描，繪制出其吸收曲線，用作圖法確定出3個(gè)測定波長分別為λl=430nm、λ2=353nm和λ3=284nm。
3 結(jié)果與討論
3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0mL的黃酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，注入10mL容量瓶中，加1％的AlCl3溶液，充分混合至刻度，在其波長為λ1=430 nm、λ2=353 nm和λ3=284nm分別測定其吸光度值。
3．2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
用與繪制吸收曲線配制相同的方法配制的樣品進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：樣品放置1h上，測得其吸光度值不變。
3．3 回收率及方法精密度
根據(jù)前面確定的測試條件，按上述實(shí)驗(yàn)方法制備6個(gè)不同濃度的樣品，按標(biāo)準(zhǔn)加入標(biāo)準(zhǔn)物，在測定波長下測定△A，求得其平均回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。本法的回收率為98.0％一112.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.14％，方法的準(zhǔn)確度與精密度均較高。由于ΔA值與黃酮的濃度C成正比，在所選擇的三個(gè)波長處，其相應(yīng)的吸收光譜曲線上三點(diǎn)在一條直線上，有效地消除本底漂移及吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，因此三波長．分光光度法為測定苦丁茶中黃酮的含量提供了更準(zhǔn)確更可行的方法。
3．4 樣品分析
取待測苦丁茶樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方法制備樣品溶液，按操作條件，在測定波長處測其吸光度，分析結(jié)果列于表。黃酮含量的多少是衡量苦丁茶品位優(yōu)劣的標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海南苦丁茶優(yōu)于桂林苦丁茶。
References
1 Zhao Huichun（趙慧春），F(xiàn)eng Ruiqin（馮瑞琴），F(xiàn)ang Xin（方昕）．（分析測試學(xué)報(bào)），1997，16（2）：36～39