肌酸激酶(CK)測(cè)試盒（比色法）

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注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

CK(EC 2.7.3.2)主要存在于心臟、肌肉以及腦等組織中，能可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，在能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和ATP再生中有重要作用，是臨床診斷心腦疾病的一個(gè)重要指標(biāo)。

測(cè)定原理：

CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP與葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化6-磷酸葡萄糖與NADP+生成NADPH，導(dǎo)致340nm光吸收值增加。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑1瓶，4℃避光保存，使用前加10mL蒸餾水溶解。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。

工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑一和試劑二以1:1混合。使用前37℃溫育2min。

粗酶液提?。?/p>

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心15min。

2. 血清樣本：直接測(cè)定。

測(cè)定操作表：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm。

2．在96孔板中加入40μL樣本和60μL蒸餾水，最后加入100μL工作液，立即混勻，37℃下測(cè)定初始吸光值A(chǔ)1與1min后的吸光值A(chǔ)2，ΔA＝A2-A1。

CK活性計(jì)算公式：

（1）按組織蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.0時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

CK活性（nmol/min/ mg prot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 1608×△A÷Cpr

（2）按組織樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：37℃，pH7.0時(shí)，每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

CK活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 1608×△A÷W

（3）按血清計(jì)算：

酶活定義：37℃，pH7.0時(shí)，每升血清1min內(nèi)催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個(gè)酶活單位。

CK活性（nmol/min/mL）=×V反總÷V樣÷T= 1608×△A

：NADPH摩爾消光系數(shù)，6220 L /mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；T，反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

 注意事項(xiàng)：

1. 配制好的工作液4℃穩(wěn)定7天，請(qǐng)配制后盡快使用。

2. 血清的CK不穩(wěn)定，采集樣本后盡快測(cè)定，4℃避光保存可穩(wěn)定24h。

3. 樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定，可選用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

4. OD值大于0.5可用提取液適當(dāng)稀釋樣品，并在計(jì)算公式中相應(yīng)的改變稀釋倍數(shù)。

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