1．概述
本檢測采用酶聯(lián)免疫法定量檢測麻痹性貝類毒素的存在。神經(jīng)性貝毒是一種毒素，石房蛤毒素是麻痹性貝類毒素的一種。本檢測可用于水產(chǎn)樣本對貝類毒素的定性和定量檢測，例如甲殼類動物的樣本。對于甲殼類動物的需要提前制備樣本。如果條件允許，陽性樣本可以做HPLC，GC/MS或其他方法確認(rèn)。
2．安全性說明
標(biāo)準(zhǔn)品溶液含有少量的石房蛤毒素。底物溶液含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液還有稀硫酸。避免皮膚與粘膜與終止液接觸。若終止液與皮膚接觸，可用水洗去。
3．貯藏與穩(wěn)定性
試劑盒貯存在4-8°C。使用前試劑盒中溶液要恢復(fù)到室溫（20—25度）。在保質(zhì)期內(nèi)試劑盒都可以正常使用。
4．檢測原理
本實(shí)驗(yàn)采用直接競爭ELISA方法，用特異性抗體識別石房蛤毒素。樣本中的石房蛤毒素可與石房蛤毒素-酶結(jié)合物競爭，同包被在微孔板上的兔抗-石房蛤毒素抗體結(jié)合。石房蛤毒素抗體與包被在微孔底部的二抗結(jié)合。洗板后加入底物溶液，顯藍(lán)色。藍(lán)色的深度與石房蛤毒素在樣本中的濃度成反比。顏色反應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)終止，顏色用酶標(biāo)儀讀值。每孔的樣本濃度值可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來讀取。
A.試劑盒組成
1．真空包裝微孔板 （12×8條），包被一種羊抗兔二抗
2．標(biāo)準(zhǔn)液（6）：0, 0.02, 0.05, 0.1,0.2 和0.4 ng/mL （ppb）
3．1 瓶6mL抗體（兔抗石房蛤毒素抗體）
4．1 瓶6mL石房蛤毒素-HRP酶標(biāo)記物
5．2瓶25ml樣品稀釋緩沖液（10倍濃縮）（即用即配，例如：10ml濃縮緩沖液+90ml蒸餾水）
6．1瓶100ml洗板緩沖液（5倍濃縮） （即用即配，例如：10ml濃縮緩沖液+40ml蒸餾水）
7．1 瓶12 mL 底物（顯色液TMB）
8．1 瓶 12mL 終止液
C.操作步驟
1、在對應(yīng)的微孔中加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)和樣品（*做2-3個重復(fù)）
2、每個測試孔都加入50 μL 石房蛤毒素酶標(biāo)記物溶液。
3、每個測試孔都加入50 μL石房蛤毒素抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。
4、在室溫下孵育30分鐘。
5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1 X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1 X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。
6、每個測試孔加入100μL的顯色液（底物）。封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。室溫孵育20-30分鐘，此步驟避免太陽光照射。
7、每個測試孔加入100μL終止液。
8、用酶標(biāo)儀在450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內(nèi)完成）。
D 結(jié)果分析
結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件（4-parameters,Logit/Log）。手工計(jì)算可以先計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值的平均值，然后計(jì)算每個標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0（用其它標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值除以零標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值乘以*）。以每個標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0做Y軸，以每個標(biāo)準(zhǔn)的石房蛤毒素的濃度做X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，把樣品的%B/B0代入標(biāo)準(zhǔn)可以計(jì)算出樣品中岡田酸的濃度。樣品中石房蛤毒素的含量小于0.02 ppb認(rèn)為陰性。當(dāng)樣品中石房蛤毒素的含量大于0.4 ppb要稀釋后再測定。
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