概述
*（Aflatoxin, AF）是由多種霉菌代謝的毒性產(chǎn)物，例如Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus霉菌。他們具有致癌性，存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽和其它食品或動(dòng)物飼料中。谷物可能被*的衍生物：B1、B2、G1和G2其中一種或幾種污染。AFB1是目前檢測(cè)到的zui毒的*，其他類(lèi)型的*如果污染的濃度很高也存在很大的危險(xiǎn)。*能夠引發(fā)人類(lèi)很多病癥包括肝癌、黃曲霉中毒、萊耶綜合癥和慢性肝炎。動(dòng)物容易攝取到*的原因是動(dòng)物吃的飼料在生長(zhǎng)、收割和貯存過(guò)程中可能被能夠產(chǎn)生*的真菌污染。世界上大多數(shù)國(guó)家的政府已經(jīng)對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物性食品中制定了嚴(yán)格的**。
適用
HELICA*B1分析測(cè)定試劑盒原理是競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，適用于檢測(cè)谷物、堅(jiān)果、棉花種子、加工過(guò)的谷類(lèi)食物、和一些其它的動(dòng)物食品中的*B1、B2、G1 和G2。
原理
HELICA*B1測(cè)定法是一種固相直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析測(cè)定方法。聚苯乙烯微孔板中包被抗*的高親和力抗體，這種抗體和*的四種亞型都能發(fā)生交叉反應(yīng)。利用70%甲醇提取樣品中的*，把提取的樣品和HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的*B1混勻并加入對(duì)應(yīng)的孔檢測(cè)。酶標(biāo)記毒素與標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品中*競(jìng)爭(zhēng)與包被在微孔底部的抗體結(jié)合。孵育一段時(shí)間后，倒出孔里的液體，清洗后加入顯色底物，在酶的作用下孔里將會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。顯色顏色的深淺與結(jié)合物的量成正比例的關(guān)系，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中AFM的量成反比例關(guān)系。所以，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的AFM濃度越高，顯色的藍(lán)色將會(huì)越淺。加入酸，終止反應(yīng)，底物顏色由藍(lán)色變?yōu)樽攸S色。微孔板放進(jìn)酶標(biāo)儀里，在OD450nm讀取吸光度值。樣品的吸光度值與試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)OD值相比較，相對(duì)應(yīng)得出結(jié)果。
試劑盒組成
| 1×小袋 | 抗體包被的微孔板 | 96孔板（12×8微孔板用鼠源AF單克隆抗體） |
| 1× | 預(yù)混板（綠色） | 96孔板（12×8）沒(méi)有包被抗體 |
| 6×小瓶 | AFM標(biāo)準(zhǔn)品 | 1.5mL/瓶，AFM的濃度分別為0.0、0.2、0.5、 1．0、2.0、4.0ng/mL 溶解在有機(jī)溶液中。 |
| 2×小瓶 | HRP-AF偶聯(lián)物 | 2 x 12mL HRP-AFB1 添加防腐劑 的緩沖溶液 |
| 1×小瓶 | 底物試劑 | 15mL TMB， |
| 1×小瓶 | 終止液 | 15mL 酸性液體 |
樣品提取步驟
1.制備提取液：70%甲醇，用蒸餾水或無(wú)離子水稀釋（每個(gè)樣品需要100ml樣品提取液）。
2.研磨樣品（使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng)）。
3.稱(chēng)量20g研磨過(guò)濾后的樣品加入100ml樣品提取液，樣品稀釋比為1:5（w/v）。
4.在混合器上至少震蕩2分鐘。
5.用濾紙過(guò)濾5-10ml 以上處理的液體，收集濾液待測(cè)。
樣品測(cè)定步驟
1、使用前將試劑拿到室溫。
2、取出混合板放于微孔支架上用于標(biāo)準(zhǔn)和樣品的測(cè)試，取相同數(shù)量的微孔（包被有抗體）置于另一個(gè)微孔支架上。
3、在每個(gè)混合板微孔中加入 200μl 酶標(biāo)結(jié)合物。
4、在對(duì)應(yīng)的孔中加入100 μl 標(biāo)準(zhǔn)或樣品，用槍頭混合3次，
注意：操作者要把每個(gè)孔標(biāo)記清楚
5、轉(zhuǎn)移100ul預(yù)混板微孔中的液體到對(duì)應(yīng)的包被有抗體的微孔中，室溫孵育15分，使用多道移液器。
6、將孔里的液體倒入合適的容器中，用蒸餾水或無(wú)離子水洗板，然后迅速棄掉洗液到合適的容器中，重復(fù)洗5次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。
7、在吸水紙上拍打，盡可能地將水拍干。
8、每孔加入100 μl底物溶劑，室溫孵育5min。
9、每孔加入 100 μl 終止液。
10、對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)和樣品的顏色，或在OD450 nm讀數(shù)。
結(jié)果分析
使用原有的OD值或?qū)嶒?yàn)獲得的OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中*濃度為0時(shí)OD值的百分比值與標(biāo)準(zhǔn)中*含量建立劑量效應(yīng)曲線(xiàn)。通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)中添加新數(shù)值計(jì)算被測(cè)物質(zhì)中*的濃度。因?yàn)闃悠吩谔幚淼倪^(guò)程中稀釋了5倍，所以實(shí)際值是測(cè)定值的5倍。樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的稀釋范圍是1-20ppb，如果樣品的濃度大于zui高標(biāo)準(zhǔn)，需要用70%的樣品提取液來(lái)稀釋后再測(cè)定，計(jì)算結(jié)果時(shí)要考慮到稀釋的倍數(shù)。
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